組織的免疫熒光之所以難做,是因?yàn)榻M織會(huì)有自發(fā)熒光,會(huì)干擾我們的實(shí)驗(yàn),尤其想在組織上做磷酸化的免疫熒光那更是難上加難。這次主要講組織的免疫熒光。
做組織的免疫熒光我做過的和知道的有兩種方法,一種是選用冰凍切片的組織,一種是選用石蠟包埋的組織。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。
所以,石蠟切片的片子需要做抗原修復(fù),需要在檸檬酸鹽緩沖液中煮30 min,這樣更有效的去除醛類固定試劑導(dǎo)致的蛋白之間的交聯(lián),充分暴露石蠟切片樣品中的抗原表位,從而大大改善免疫熒光染色。
在正式做熒光之前,片子的準(zhǔn)備程序如下。(藍(lán)色為石蠟切片,紫色為冰凍切片)
1.4%多聚甲醛4℃固定過夜;
2.1xPBS洗一次,30min;
3.30%乙醇1小時(shí),搖床上慢搖,下同;
4.50%乙醇1小時(shí);
5.70%乙醇1小時(shí);
6.85%乙醇1小時(shí);
7.95%乙醇1小時(shí);
8.正丁醇1小時(shí)(打開65℃溫箱溶蠟);
9.石蠟65℃中處理3小時(shí),每隔1小時(shí)換石蠟一次,包埋。
10.切片
1.4%多聚甲醛冰上固定2小時(shí);
2.1xPBS洗一次,5min;
3.30%蔗糖沉降2小時(shí);
4.OCT包埋。
組織和細(xì)胞一樣有些常用的固定液。根據(jù)Bencroft的分類法,可分為四類:
Ⅰ類:醛類,甲醛,戊二醛,多聚甲醛,丙烯醛,已二醛,丙二醛等。
Ⅱ類:氧化劑類,四氧化鋨(奧酸),高錳酸鉀,重鉻酸鉀等。
Ⅲ類:蛋白變性類,甲醇,乙醇,醋酸等。
Ⅳ類:其他,氯化汞,苦味酸等。
最常使用的是甲醛和多聚甲醛,其余的也在其它病理技術(shù)方面中用到,做比如電鏡的固定劑一般用2.5%戊二醛固定。
10%甲醛:對組織滲透性強(qiáng),固定均勻。對組織收縮少。對脂肪、神經(jīng)及髓鞘、糖等固定效果好,是最常用的固定劑。但經(jīng)酒精脫水時(shí)有較大的收縮。能保存脂肪,不能沉淀核蛋白及白蛋白,長期用其固定的組織使組織變?yōu)樗嵝裕焕谌旧?,特別是細(xì)胞核的著色。經(jīng)自來水沖洗6~24小時(shí)后,可以使其酸堿中和,并減少結(jié)晶。
4%多聚甲醛:對組織穿透性好,組織收縮小,對大多數(shù)抗原物質(zhì)保存較好,特別是對脂肪和各種酶的固定效果更好。固定的時(shí)間不宜太長,以24小時(shí)以內(nèi)為宜,適用于免疫組織化學(xué)染色。
我自己做的比較多的是石蠟切片的。先給大家看看我們課題組做的石蠟切片的肺組織免疫熒光。
1.先檢查切片機(jī)各部位是否已固定,刀片是否鋒利(最好用新的刀片)
2.切片時(shí)要注意速度,太快易出現(xiàn)褶皺,這里可以先將樣品置于冰上冷卻哈;
3.切片時(shí)發(fā)現(xiàn)縱向刀痕時(shí)要停止切片,清除刀片上的那些碎屑;
4.展片水溫控制在42℃左右,過高蠟片彌散,過低蠟片不能展開;
5.新?lián)Q的水需要先將水加熱到42度才能放入切片,否則水溫上升后易出現(xiàn)微小氣泡,影響貼片;
6.展片槽水位應(yīng)較高,防止玻片觸底帶起氣泡,貼附于蠟片下影響貼片;
7.展片時(shí)間要適中,過短則蠟片不能完全展開,過長則蠟片彌散,不利于貼片;
8.可用普通載玻片展片;
9.切片樣品置于切片盒中敞開晾干后室溫保存一段時(shí)間,我最長是兩個(gè)月。建議長期保存還是放入蠟塊中。
因?yàn)樽罱鼪]有做相關(guān)的實(shí)驗(yàn),所以沒有拍圖片,下次做的時(shí)候補(bǔ)上。
10.抗原修復(fù):將切片置于0.1mol/L且Ph=6的枸櫞酸液修復(fù)液中,微波爐中火加熱6分鐘至微微沸騰,再用中低火力維持10分鐘,停止加熱后自然冷卻20-30分鐘(直接煮沸6分鐘×4次)。
11.PBS浸洗2分鐘X2次后,加0.2%tritonX-100透膜15分鐘(如果你切片比較薄的話,也可不透膜,反正細(xì)胞已經(jīng)被切開)。但如果是做細(xì)胞膜表面的蛋白,那就不要透膜了。
12.PBS 2分鐘清洗2次。
13.用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS,滴加封閉血清(最好選用二抗同來源的血清,二抗一般來自山羊,所以可以選用山羊血清。)在濕盒中室溫封閉1h。
14.用濾紙擦去封閉液,PBS清洗兩次。
15.滴加適宜濃度的一抗置濕盒中4℃孵育過夜。
16.濾紙吸去一抗,或者回收一抗。
17.PBS 3分鐘×5次,用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。
18.滴加熒光二抗室溫置濕盒中避光孵育1小時(shí),此時(shí)可在熒光顯微鏡下迅速觀察是否染上,以確定終止時(shí)間。
19.用PBS 3分鐘×3次洗去二抗,用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。
20.滴加 DAPI避光孵育15分鐘。
21.用PBS 5分鐘×2次,用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。
22.用含抗熒光淬滅劑的封片,37度烘干保存。
注意事項(xiàng):
1.樣品提前兩小時(shí)從液氮中放在-20℃平衡樣品溫度;
2.冰凍包埋OCT液于室溫呈液態(tài),-15℃以下呈固態(tài),如不馬上切片,保存于-80度冰箱待用;
3.載玻片應(yīng)置于室溫,若長時(shí)間置于-20℃則組織將不能貼附;
4.切片:切片厚度40um,切片直接放在室溫的PBS中,OCT會(huì)自動(dòng)溶解于PBS中;
5.封閉過氧化物酶體:3%H2O2,(1mL 30%H2O2 +9ml 甲醇);
6.PBS 5分鐘X3次;
7.高溫抗原修復(fù):95度水浴,檸檬酸鹽(PH=6.0)修復(fù)液,6min。結(jié)束后放置20-30min使溫度降低;(此步驟可選用,有相熟的同學(xué)做的時(shí)候用了這一步,結(jié)果也挺好的);
8.PBS 5分鐘X3次;
9.透膜,0.2%Triton 室溫20 分鐘;
10.封閉:10%山羊血清,1h;
11.一抗孵育4度過夜;
12.PBS 5分鐘X3次;
13.孵育二抗,室溫1h;
14.PBS 5分鐘X3次;
15.滴加 DAPI避光孵育15分鐘。
16.用PBS 5分鐘×2次,用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。
17.用含抗熒光淬滅劑的封片,37度烘干保存。