石蠟切片
我們先來說說石蠟切片怎么做。組織包埋進石蠟以后,做好的組織蠟塊常溫保存即可。但是如果你們實驗室冰箱很空,放冰箱也可以。不過呢,蠟塊如果放冰箱倒真是有個很實用的功能,就是切出來的切片不容易裂(等下我們來討論原因),所以如果蠟塊事先一直是常溫保存的,在切片之前,最好也提前1-2h放入4℃預冷。預冷的這段時間,可以先做好準備工作:
1、打開漂片機,溫度調(diào)至40℃。做石蠟切片除了切片機以外還需要另一種儀器,那就是漂片機了。漂片機主要有兩個功能,一個是用溫水把切片鋪展、鋪平,便于貼到載玻片上,另一個就是把剛貼好切片的載玻片晾干。所以漂片機實際上就是個功能略復雜一些的水浴鍋,除了可以把水加熱,還可以盛放貼了切片的載玻片順便烘干切片;
2、由于切下來的薄層石蠟就像狗皮膏藥,非常容易黏在物體表面(你能想象的所有物體),并且黏上了就很難摳下來,所以事先要在切片機下面的臺面上鋪一層保鮮膜,這樣掉下來的石蠟都落在保鮮膜上,便于清理;
3、漂片的時候由于各種原因,會在水面上留下不少石蠟,這些石蠟也需要用保鮮膜黏走,所以在漂片機的水浴邊上也得搭上一片保鮮膜用于清理;
4、準備好切片需要的工具,包括刀片(刀片是消耗品且比較貴)、眼科鑷(彎頭、直頭皆可)、毛筆(清掃用)、卷紙、防脫玻片、鉛筆。
漂片機
好了,等漂片機熱乎乎的,可以開始切了。先把蠟塊從冰箱里拿出來,夾到切片機上。夾蠟塊的時候蠟塊擺放的方向可以有兩種選擇,或橫夾或豎夾,
1、刀片的長度約10cm,切片過程中可能會卷刃(刀片卷刃會刮破標本),但是卷也只是某一個點會卷,別的地方都是好的,這時候選擇豎夾有可能避開卷刃處;
2、有的標本比較狹長,如果豎夾會導致標本通過刀片的時間比較長(時間越長,標本被破壞的可能性越大),這時如果選擇橫夾可以較快地切出切片,盡可能保證標本完好。
夾好蠟塊以后,挑一個用過很多次的、不是很新的、就算不那么鋒利也可以的刀片,先夾到刀片夾上,用來“修片”。這里給大家解釋一下為什么要“修片”。做好的石蠟塊表面不是光滑的,并且組織外表面是有相當一部分石蠟遮擋的,所以一刀下去肯定是不能立刻切到組織的,就算一刀下去能切到組織,也不一定能切到你想要的部位或大小或形狀或……,總之,第一刀或前幾刀都不會讓你滿意,所以需要“預先”切幾刀,把表面那些不是你想要的東西切走,這就叫“修片”。那么有小伙伴要問了,是不是以前切過的蠟塊再拿過來切就不需要修了呢?答案是:同樣需要。原因是以前切過的切面,放到現(xiàn)在你使用的這個切片機上,很可能不平行于刀片(肉眼很難看出來,一切就知道),也就導致蠟塊夾好以后,開始切的前幾張切片不會是完整的,所以也要“修片”。修完片子,換上嶄新的刀片(就算不嶄新,用過一次兩次的也行,夠鋒利就可以),把切片厚度調(diào)到3μm),注意下一個動作,用嘴對著石蠟塊哈一口氣,不哈一口氣的切片是沒有靈魂的。下面就搖動手柄,讓切片飛起來。切的過程只有一個注意點,那就是“快”,切慢了就等著裂吧。切的過程中如果裂了,就哈氣,如果有劃痕就換個方向夾蠟塊或換刀片,請記得不管換什么,都要從修片開始。
切片
切到不少滿意的片子就可以進行“漂片”了。用眼科鑷挑選合適的切片鋪到水上,這時要耐心等待一個節(jié)點,就是組織周圍包裹的石蠟將化沒化之時(說白了就是原本規(guī)則的正方形石蠟片變得有點不規(guī)則時),用載玻片從水下把切片撈上來,撈的時候切片也就貼在載玻片上了),載玻片記得提前用鉛筆在磨毛的部位標記切片分組。貼好的載玻片放在晾干架上烘干,石蠟切片就完成啦,切下來的片子可以放在染色架上(就是個小吊籃),方便存取。
染色架
石蠟切片的做法講完了,下一講咱們繼續(xù)說說冰凍切片的做法。
做冰凍切片的組織,固定后需要脫水(啊奧)。一般采用的方法是蔗糖梯度脫水,從低濃度到高濃度依次脫水,做法也很簡單,就是用蔗糖配成相應濃度(一般是10%,20%,30%三個濃度)的溶液放到密封的容器里,然后把組織丟進去泡著。泡完一個濃度的蔗糖泡下一個濃度,濃度遞增。詳細做法童鞋們百度看看。脫完水以后可以放-80℃保存很久很久很久。
1、關于卷刃,有些聰明的小伙伴可能要說了,刀片有10cm,把卷刃的地方挪開不就行了嗎?然而事實上是最好不要,不然很可能有血光之災。因為有些刀片夾與刀片等長,如果挪刀片,那就意味著有一節(jié)刀片是凸在外面的,刀片十分鋒利,很有可能切到人肉。事實證明,就算規(guī)規(guī)矩矩把刀片安裝在刀片夾上,也是有可能切到手的,因為刀片是赤裸裸地暴露的。不過現(xiàn)在的切片機有些已經(jīng)注意到這個問題,把刀片夾做的比刀片長很多,不過大家還是小心為上,總不能為了切個片把命都搭上吧。
2、石蠟切片一般切3μm厚,如果有特殊要求,可以自行調(diào)整。正是因為切片只有3μm厚,所以如果童鞋們想要觀察多個不同部位的情況,請避免選擇連續(xù)的切片,因為連續(xù)的切片上你觀察到的結果沒有太大差別。當然有些情況恰恰是需要觀察連續(xù)切片的,那就另當別論了?,F(xiàn)在就帶來了一個問題,如果不連續(xù)選片,那應該間隔幾張切片選擇呢?這個問題的答案需要具體情況具體分析。舉個例子,如果你想觀察的是組織里某種細胞內(nèi)的情況,那么兩張切片之間的距離至少相差一個細胞的直徑,這樣你才能看到下一個細胞的情況。順便說一下修片的厚度,由于修片目的只是獲得一個理想的平面,所以可以大刀闊斧,七八九十微米都沒什么問題。
3、其實哈氣是避免組織裂開,這跟前面提到的把組織放冰箱是一個目的。石蠟塊在處理的過程中經(jīng)固定、脫水,組織變得比較干脆(本俠想說的是既干又脆),導致切片的時候很容易裂開。如果這時候在上面蒙上一層水汽,情況會好很多。所以常溫保存的蠟塊要提前放冰箱預冷,切之前也要哈一口氣。
4、漂片的這個時間節(jié)點為什么要這么選呢?我們切下來的片子,中間是組織,周圍是石蠟,能牢牢黏在載玻片上的是石蠟而不是組織,即使是防脫玻片,對組織的吸附力也并不是很強,所以石蠟不僅僅能方便切片,同樣也有助于貼片。但是常溫的石蠟片作為固體,貼在載玻片上并不服帖,所以通過加熱的方法,讓石蠟稍稍融化,這樣就能讓切片緊緊地貼在載玻片上了。但是如果加熱時間太長,石蠟融化過度,石蠟就散了,組織會與石蠟脫離,那石蠟也就失去存在的意義了。所以時間節(jié)點的把握很重要。