體外診斷( IVD, In Vitro Diagnosis)是指在人體之外,通過(guò)對(duì)人體樣本(血液、體液、組織液等)進(jìn)行檢測(cè)而**臨床診斷信息,進(jìn)而判斷疾病或機(jī)體功能的產(chǎn)品和服務(wù)。
根據(jù)檢測(cè)原理和檢測(cè)方法的分類,體外診斷主要可分為生化診斷、免疫診斷、分子診斷、即時(shí)診斷、微生物診斷、尿液診斷、凝血類診斷、血液診斷等診斷方法,其中免疫診斷是體外診斷的重要分支。
免疫診斷是基于抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,主要應(yīng)用于肝炎、病毒、血源、腫瘤、藥物檢測(cè)等。免疫診斷技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了同位素放射免疫(RIA)、膠體金、酶聯(lián)免疫(ELISA)、時(shí)間分辨熒光(TRFIA)、化學(xué)發(fā)光(CLIA)等。
目前我國(guó)免疫診斷技術(shù)的主流是酶聯(lián)免疫和化學(xué)發(fā)光,由于化學(xué)發(fā)光較酶聯(lián)免疫更為靈敏、快速、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好,所以化學(xué)發(fā)光市場(chǎng)規(guī)模每年在不斷擴(kuò)大,化學(xué)發(fā)光取代酶聯(lián)免疫是一個(gè)大趨勢(shì)。
化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)包含免疫反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光兩部分。首先將發(fā)光物質(zhì)或酶標(biāo)記在抗原或抗體上,抗原或抗體與待檢測(cè)物質(zhì)特異性結(jié)合后,加入氧化劑或化學(xué)發(fā)光底物,經(jīng)氧化或與底物產(chǎn)生反應(yīng)后,化學(xué)發(fā)光物質(zhì)會(huì)形成一個(gè)處于激發(fā)態(tài)的中間體,中間體回到基態(tài)會(huì)發(fā)射光子釋放能量。由于化學(xué)檢測(cè)體系中待測(cè)物濃度與體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在一定條件下呈線性定量關(guān)系的原理,利用儀器對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的檢測(cè),可以確定待測(cè)物含量。
化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)根據(jù)化學(xué)發(fā)光所用的標(biāo)記物和發(fā)光原理的不同可分為三類:直接化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)、酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLEIA)和電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)。
直接化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)是將化學(xué)發(fā)光劑如吖啶酯類化合物,直接標(biāo)記在抗原上或抗體上。這種標(biāo)記物的化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速、無(wú)須催化劑,且標(biāo)記效率高,本底低。一般常用的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)主要是通過(guò)啟動(dòng)發(fā)光試劑NaOH+H2O2作用而發(fā)光,其發(fā)光非常迅速。其中小分子物質(zhì)的檢測(cè)多采用競(jìng)爭(zhēng)法,大分子物質(zhì)的檢測(cè)主要用夾心法。
酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLEAIA)是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體,與待測(cè)樣本中相應(yīng)的抗體或抗原發(fā)生免疫反應(yīng)后,形成固相包被抗體—待測(cè)抗原—酶標(biāo)記抗體復(fù)合物后,經(jīng)洗滌,加入底物(發(fā)光劑),酶催化和分解底物發(fā)光。目前常用的標(biāo)記酶有堿性磷酸酶(ALP)和賴根過(guò)氧化物酶(HRP)。
ALP和1,2-二氧環(huán)己烷衍生物(AMPPD)構(gòu)成的發(fā)光體系是目前較靈敏的化學(xué)發(fā)光體系,其特點(diǎn)是反應(yīng)速度快,在很短時(shí)間內(nèi)提供可靠的結(jié)果。AMPPD的分子結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)重要部分,一個(gè)是聯(lián)接苯環(huán)和金剛烷的二氧四節(jié)環(huán),它可以斷裂并發(fā)射光子;另一個(gè)是磷酸根基團(tuán),它維持著整個(gè)分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。而HRP和魯米諾構(gòu)成的發(fā)光體系存在發(fā)光強(qiáng)度低、不易測(cè)量等缺點(diǎn),通過(guò)加入增強(qiáng)發(fā)光劑后,增強(qiáng)發(fā)光信號(hào),并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定,便于重復(fù)測(cè)量,從而提高分析靈敏度和準(zhǔn)確性。
不同于直接化學(xué)免疫發(fā)光免疫分析和酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析,電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕([Rb(bpy)3]2+)標(biāo)記抗原或抗體,以三丙胺(tripropylamine,TPA)為電子供體,在電場(chǎng)中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng),它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程。
資料來(lái)源:《化學(xué)發(fā)光免疫分析研究進(jìn)展》
1)靈敏度高:靈敏度高是化學(xué)發(fā)光免疫分析關(guān)鍵的優(yōu)越性。化學(xué)發(fā)光免疫分析能夠檢出放射性免疫分析和酶聯(lián)免疫分析等方法無(wú)法檢出的物質(zhì),對(duì)疾病的早期診斷具有十分重要的意義。
2)寬的線性動(dòng)力學(xué)范圍:發(fā)光強(qiáng)度在4-6個(gè)量級(jí)之間,與測(cè)定物質(zhì)濃度間呈線性關(guān)系。這與顯色酶聯(lián)免疫分析吸光度(OD 值)2.0 的范圍相比,優(yōu)勢(shì)明顯。雖然同位素放射免疫也有較寬的線性動(dòng)力學(xué)范圍,但是放射性限制其應(yīng)用。
3)光信號(hào)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng):化學(xué)發(fā)光免疫分析的光信號(hào)持續(xù)時(shí)間可達(dá)數(shù)小時(shí)甚至一天,簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作及測(cè)量。
4)分析方法簡(jiǎn)便快速:絕大多數(shù)分析測(cè)定僅需加入一種試劑(或符合制劑)的一步模式。
5)結(jié)果穩(wěn)定、誤差?。簶颖颈旧戆l(fā)光,不需要額外光源,避免了外來(lái)因素的干擾(光源穩(wěn)定性、光散射、光波選擇器),分析結(jié)果穩(wěn)定可靠。
6)安全性好及使用期長(zhǎng):到目前為止還未發(fā)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑的危害性;另外這些試劑穩(wěn)定,保存期可達(dá)一年之久。
根據(jù)Kalorama Information的市場(chǎng)數(shù)據(jù),2010-2015年期間,酶聯(lián)免疫的復(fù)合增長(zhǎng)率為-5%,化學(xué)發(fā)光復(fù)合增長(zhǎng)率為28%。在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家的免疫診斷市場(chǎng),酶聯(lián)免疫法已基本被淘汰,占免疫診斷市場(chǎng)比例不到5%,化學(xué)發(fā)光免疫診斷已成為主流,其中以羅氏、雅培、貝克曼、拜爾、索靈和西門子的產(chǎn)品為主,占據(jù)了市場(chǎng)近70%的份額。
資料來(lái)源:WHO
我國(guó)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)起步較晚,但近幾年發(fā)展迅速。目前在我國(guó)大多數(shù)三甲醫(yī)院中,化學(xué)發(fā)光法免疫分析已成為免疫診斷的主流,但是在大量的基層醫(yī)院中酶聯(lián)免疫法仍然占據(jù)主導(dǎo)地位,總體上仍約占免疫診斷領(lǐng)域40%的市場(chǎng)份額。近年來(lái),隨著國(guó)內(nèi)企業(yè)技術(shù)進(jìn)步和化學(xué)發(fā)光生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大,化學(xué)發(fā)光免疫分析呈現(xiàn)出逐步取代酶聯(lián)免疫分析的趨勢(shì),目前國(guó)內(nèi)免疫診斷領(lǐng)域中化學(xué)發(fā)光的市場(chǎng)份額已超過(guò)50%。未來(lái)化學(xué)免疫分析技術(shù)將持續(xù)逐步取代酶聯(lián)免疫。
化學(xué)發(fā)光診斷產(chǎn)品一般是試劑和儀器一體化的封閉系統(tǒng),技術(shù)壁壘和研發(fā)難度較高,國(guó)內(nèi)該領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展相對(duì)較慢,所以國(guó)內(nèi)自主產(chǎn)品較少,基本以進(jìn)口產(chǎn)品為主,羅氏、雅培、貝克曼、拜耳、西門子等外企占國(guó)內(nèi)市場(chǎng)份額達(dá)到70%左右。但是目前國(guó)內(nèi)的企業(yè)也在迅速崛起,在國(guó)內(nèi)上市公司中已經(jīng)推出化學(xué)發(fā)光免疫分析儀和配套試劑盒的公司有邁克生物、深圳邁瑞、深圳新產(chǎn)業(yè)和鄭州安圖,同時(shí)利德曼、科華生物等上市公司也在研發(fā)該類產(chǎn)品,非上市公司有石家莊康普生、北京科美等。
常見(jiàn)的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀器技術(shù)參數(shù)
化學(xué)發(fā)光免疫分析具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等諸多優(yōu)點(diǎn),是目前臨床診斷中常用的方法,特別在癌癥篩查和診斷中起了非常重要的作用。其中對(duì)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)在腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、病情的發(fā)展、治療后的評(píng)價(jià)、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等方面都具有一定的應(yīng)用價(jià)值。目前通過(guò)化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)的相關(guān)腫瘤標(biāo)志物有甲胎蛋白(AFP),癌胚抗原(CEA),糖類抗原(CA125、CA153、CA199),磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC3),前列腺特異抗原(PSA),鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC),Y-盒結(jié)合蛋白1(YB-1),P53蛋白等。
化學(xué)發(fā)光免疫分析除了應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)外,還被廣泛用于糖尿病、高血壓、心臟病、傳染病、過(guò)敏性疾病等的檢測(cè)和評(píng)價(jià)。
近年來(lái),隨著化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在各個(gè)方面的不斷改進(jìn),化學(xué)發(fā)光免疫分析呈現(xiàn)出高靈敏度、多項(xiàng)目聯(lián)合檢測(cè)和自動(dòng)化的特點(diǎn)。
為了提高化學(xué)發(fā)光免疫分析的靈敏度主要通過(guò):
1)降低信號(hào)噪音,減少非特異性反應(yīng)信號(hào)和信號(hào)干擾;
2)增強(qiáng)光信號(hào),提高信噪比和穩(wěn)定性。
化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)的信號(hào)噪音和信號(hào)干擾的因素主要是發(fā)光體系缺陷和原料試劑的影響。為改善發(fā)光體系缺陷,通過(guò)研發(fā)新的發(fā)光劑、增強(qiáng)劑、發(fā)光體系以及對(duì)反應(yīng)時(shí)間、孵育時(shí)間、緩沖液的選擇和標(biāo)記抗體濃度等方面進(jìn)行優(yōu)化,都是減少信號(hào)噪音干擾的影響因素。如在反應(yīng)體系中,抗原-抗體免疫復(fù)合物的分離往往比較復(fù)雜,這也是信噪比低的原因,因此引入磁性微粒子作為免疫反應(yīng)與分離的固相載體就能有效解決此問(wèn)題。磁性微粒子主要用于與抗體相連,通過(guò)免疫反應(yīng)使其能夠捕獲待測(cè)物形成免疫復(fù)合物,在外加磁場(chǎng)的作用下,免疫復(fù)合物被滯留下來(lái),實(shí)現(xiàn)了分離,從而清除了樣品中基質(zhì)的干擾,降低了背景值。另外在原料試劑中基因工程抗原對(duì)檢測(cè)的特異性和靈敏度有很大影響,因此篩選優(yōu)化獲得高特異性和高靈敏度的抗原是至關(guān)重要的步驟。
除了減少信號(hào)噪音和干擾外,如何增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)提高穩(wěn)定性一直是化學(xué)發(fā)光研究的重點(diǎn)。新型納米材料如納米金、碳納米管CNT、碳納米球CNSs、碳納米纖維以及量子點(diǎn)等聯(lián)用到CLIA中,大大提高了CLIA的信號(hào)強(qiáng)度和穩(wěn)定性;在電化學(xué)反應(yīng)免疫分析中改善電極表面的修飾能增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)。
在實(shí)際樣品檢測(cè)中,經(jīng)常涉及到復(fù)雜體系多組分的測(cè)定。多組分同時(shí)檢測(cè)具有分析通量高、樣品消耗少、所需時(shí)間短、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn),已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。目前,利用CLIA進(jìn)行多組份同時(shí)檢測(cè)已有很多報(bào)道,主要有通過(guò)結(jié)合微流控芯片、免疫層析以及流動(dòng)注射等技術(shù)手段達(dá)到多組分同時(shí)檢測(cè)的目的,這也拓寬了化學(xué)發(fā)光免疫分析的應(yīng)用范圍。
傳統(tǒng)的免疫分析由于免疫物質(zhì)的混合反應(yīng)效率低,檢測(cè)分析的流程冗長(zhǎng),操作繁瑣,因而耗時(shí)較多。為實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè),需加速熱力和免疫動(dòng)力學(xué)反應(yīng),提高自動(dòng)化水平,聯(lián)用其他技術(shù)減少操作節(jié)約時(shí)間。