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【兆恒機(jī)械】臨床生化檢測系統(tǒng)攜帶污染的分析與處理策略

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  • 添加日期:2021年07月19日
臨床生化檢測系統(tǒng)是指生化分析儀、校準(zhǔn)品、試劑和檢驗(yàn)程序的組合。國外實(shí)驗(yàn)室多采用配套(封閉)檢測系統(tǒng)對(duì)病人標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn),即生化分析儀、校準(zhǔn)品、試劑和檢驗(yàn)程序形成固定組合并經(jīng)FDA批準(zhǔn)配套使用;國內(nèi)使用配套檢測系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室雖逐年增加,但出于成本控制等原因仍有不少實(shí)驗(yàn)室在生化分析儀上根據(jù)自身意愿選擇校準(zhǔn)品、試劑和檢驗(yàn)程序組成自建檢測系統(tǒng)對(duì)病人標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn)。經(jīng)FDA批準(zhǔn)的配套檢測系統(tǒng)廠商都有嚴(yán)格的控制攜帶污染措施,并進(jìn)行了全遍歷交叉污染評(píng)估,能有效控制項(xiàng)目之間的攜帶污染。但自建檢測系統(tǒng)或在配套檢測系統(tǒng)上增加新的檢驗(yàn)項(xiàng)目,實(shí)驗(yàn)室很難進(jìn)行項(xiàng)目間的全遍歷交叉污染評(píng)估,項(xiàng)目間的攜帶污染難以達(dá)到有效控制[1]。此外,測試項(xiàng)目增多、儀器設(shè)計(jì)中加樣量的減少、各類體液樣本的應(yīng)用、不同抗凝劑的使用等都可能使樣本攜帶污染發(fā)生新的變化;國內(nèi)部分實(shí)驗(yàn)室未按照制造商建議進(jìn)行有效的預(yù)防性維護(hù),甚至為了降低成本,造成主要元部件超壽命使用,也是自動(dòng)生化分析儀攜帶污染存在或增加的重要原因。因此,控制攜帶污染仍然是現(xiàn)階段提高生化分析系統(tǒng)檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要任務(wù)。

攜帶污染的定義

攜帶污染(carry-over 或 carryover)是指由測量系統(tǒng)將一個(gè)檢測樣品反應(yīng)攜帶到另一個(gè)檢測樣品反應(yīng)的分析物不連續(xù)量,由此錯(cuò)誤地影響了另一個(gè)檢測樣品的表現(xiàn)量。某一生化檢測從加樣開始至反應(yīng)結(jié)束、清洗完成的任意過程中殘留的任一物質(zhì)(可以為生物樣本,也可以為試劑或混合反應(yīng)液)通過儀器硬件(包括但不限于試劑針、樣品針、反應(yīng)杯、攪拌桿、管路等)被攜帶到下一個(gè)生化檢測反應(yīng)中,參與反應(yīng)和/或影響反應(yīng)進(jìn)程,并導(dǎo)致檢測結(jié)果顯著偏差的過程。生化分析儀的攜帶污染不可能完全避免,只有當(dāng)這些反應(yīng)殘留物對(duì)下一個(gè)反應(yīng)結(jié)果的影響非常顯著,超過實(shí)驗(yàn)室預(yù)設(shè)的分析質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或影響患者臨床結(jié)局時(shí),才被定義為攜帶污染,需要采取必要的措施。當(dāng)這樣的攜帶污染發(fā)生在兩個(gè)特定的檢測項(xiàng)目(試劑)之間時(shí),也被稱交叉污染(cross contamination)。

攜帶污染的來源

1.試劑成分間的直接影響:前一個(gè)測定試劑中直接含有后一個(gè)測試試劑所要測定的項(xiàng)目, 例如:AMY的試劑1(R1)試劑中含有Ca離子(酶活化劑),當(dāng)某樣品檢測AMY和Ca項(xiàng)目時(shí),順序是先AMY,后測Ca。因吸取過AMY的R1試劑針上可能沾有殘留的R1試劑,當(dāng)R1試劑針再吸取Ca試劑時(shí),會(huì)引入AMY的R1試劑中含有的Ca離子,這樣對(duì)Ca項(xiàng)目的檢測結(jié)果可能造成正誤差。常見試劑成分間的直接影響有:(1)GLU(氧化酶法)、TP與ACP試劑中含有較高濃度的鉀(K+ );(2)ChE、CHOL、GLU(GOD法)、UA(尿酸酶法)、LD(IFCC法)、HBDH(DGKC法)等試劑中含有磷酸鹽緩沖液;(3)CHOL、TG試劑及HDL-C試劑中含有膽酸鈉;(4)ALT(IFCC法)、(AST)(IFCC法)試劑中含有高活性的LD。以上試劑的成分分別會(huì)對(duì)K+(紫外酶法)、磷(P)、總膽汁酸(TBA)及LD的測定結(jié)果形成干擾,造成交叉污染。

2.試劑成分間的間接影響:試劑成分參與反應(yīng),上一個(gè)試劑中含有的某種試劑成分與下一反應(yīng)所要測定的底物相互作用,因而干擾下一反應(yīng)的測定結(jié)果。例如:Mg2+測定試劑的絡(luò)合劑也能與鐵(Fe)結(jié)合,影響鐵與鐵絡(luò)合劑的結(jié)合;直接膽紅素(D-Bil)重氮法試劑與Mg2+試劑中含有EDTA,均能與Ca結(jié)合,從而影響Ca的測定;以甘油作為酶保護(hù)劑的試劑,會(huì)對(duì)TG的測定帶來干擾;鈣(MTB法)試劑對(duì)K+有負(fù)干擾;CHOL試劑中含有膽固醇酯酶,可水解膽固醇酯形成游離膽固醇,對(duì)游離膽固醇測定造成干擾。

3.反應(yīng)產(chǎn)物的影響:上一個(gè)試劑所引導(dǎo)的反應(yīng)對(duì)下一個(gè)項(xiàng)目的反應(yīng)進(jìn)程帶來間接的干擾,下一項(xiàng)目所測定的是前后兩個(gè)項(xiàng)目反應(yīng)的綜合作用結(jié)果。當(dāng)上一反應(yīng)產(chǎn)物為H2O2時(shí),則對(duì)以Trinder反應(yīng)產(chǎn)生顏色的測定結(jié)果造成干擾,如UA對(duì)CHOL結(jié)果的影響,CHOL對(duì)CREA(酶法)測定結(jié)果的影響,GLU(氧化酶法)對(duì)CREA測定結(jié)果的影響。CK(NAC法)、CK-MB(NAC法)試劑中含有GLU成分,其分析方法的原理中包含GLU的己糖激酶(HK)反應(yīng)過程,因此可能對(duì)GLU的測定帶來干擾,尤其對(duì)GLU的HK法測定可能帶來嚴(yán)重干擾。

4.影響反應(yīng)條件:上一試劑緩沖液成分改變了下一反應(yīng)的pH環(huán)境,從而改變反應(yīng)速率。例如:TP(雙縮脲法)測定需在pH8~9時(shí),蛋白肽鍵才都能與堿性銅溶液作用生成紫色反應(yīng),若pH<8,則會(huì)導(dǎo)致TP結(jié)果偏低,還直接影響球蛋白、白蛋白/ 球蛋白結(jié)果;酶活性測定有最適pH,大多數(shù)酶反應(yīng)pH在6.0~7.5之間,ALP、GGT、LDH則在堿性條件下最適宜;CREA(苦味酸速率法)反應(yīng)條件為堿性,果糖胺(動(dòng)力學(xué)法)反應(yīng)條件為酸性,受到污染后反應(yīng)速率會(huì)減慢。CREA(酶法)試劑中含有抗壞血酸氧化酶,影響了氧化還原反應(yīng)的進(jìn)程,會(huì)對(duì)TBA(酶循環(huán)法)測定結(jié)果有影響;D-Bil(釩酸鹽氧化法)試劑中的酒石酸鹽緩沖液會(huì)影響ALT活性,對(duì)測定結(jié)果有負(fù)干擾。

攜帶污染的途徑

1.試劑針污染:一般高速全自動(dòng)生化分析儀都采用雙試劑針,即所有項(xiàng)目的第一試劑都共用試劑針R1,所有項(xiàng)目的第二試劑都共用試劑針R2。試劑針R1或R2在每吸取一次試劑后都會(huì)進(jìn)行一次清洗,之后會(huì)立即吸取下一個(gè)項(xiàng)目的試劑。如果儀器清洗能力下降或沒有定期進(jìn)行維護(hù),試劑針在吸取試劑時(shí)會(huì)將部分殘留的前一項(xiàng)目試劑成分帶入到后一項(xiàng)目反應(yīng)杯中,對(duì)后一項(xiàng)目檢測結(jié)果造成影響。從各個(gè)項(xiàng)目設(shè)置的參數(shù)可知,試劑體積量遠(yuǎn)大于樣本體積量,因此試劑針攜帶污染影響程度會(huì)高于樣本針攜帶污染。

2.攪拌棒污染:試劑與樣本、第一試劑與第二試劑的混勻需要攪拌棒,而攪拌棒如果清洗不完全或黏附力增加時(shí),殘留試劑可能會(huì)對(duì)下一檢測結(jié)果造成影響。

3.比色杯污染:生化分析儀的比色杯大體分為兩種,一種是循環(huán)使用的(如石英比色杯等),另一種是需要定期更換的(如塑料比色杯等),每個(gè)比色杯檢測完畢后,進(jìn)行自動(dòng)清洗,然后繼續(xù)下一個(gè)檢測項(xiàng)目的檢測。當(dāng)由于各種原因?qū)е履硞€(gè)比色杯清洗不完全或該比色杯老化時(shí),吸附在比色杯上的上一個(gè)項(xiàng)目的殘留試劑或者反應(yīng)物可能會(huì)對(duì)在這個(gè)比色杯中進(jìn)行的下一個(gè)項(xiàng)目的檢測結(jié)果造成影響。根據(jù)經(jīng)驗(yàn),比色杯的污染對(duì)結(jié)果影響最大,因?yàn)楸壬铍y以清洗干凈,且在實(shí)際工作中難以判斷在該比色杯中檢測的前后測試項(xiàng)目?!?/p>

4.樣本針污染:目前大多數(shù)全自動(dòng)生化分析儀采用注射器或定量泵產(chǎn)生負(fù)壓,通過樣本針吸取樣本,吸樣后通過一定壓力的清洗水清潔樣本針。當(dāng)樣本針在清洗不完全或黏附力增加時(shí),樣本殘留可能會(huì)對(duì)下一相鄰樣本的檢測結(jié)果造成影響。  

5.清洗系統(tǒng):目前大多數(shù)全自動(dòng)生化分析儀采用多階清洗劑和清洗水清潔比色杯,當(dāng)清洗針或干燥針上有試劑、樣本或反應(yīng)物殘留,可能會(huì)對(duì)下一個(gè)被清洗比色杯的測定結(jié)果造成影響,一般來說清洗系統(tǒng)帶來的攜帶污染很少,可以忽略。

配套檢測系統(tǒng)解決攜帶污染之道

1.從機(jī)理上盡可能去除污染之源:TC試劑配方中一般含有一種物料(具有提高試劑穩(wěn)定性和抗脂血干擾的作用)是TBA的檢測底物;而TBA是循環(huán)酶法試劑,可將底物信號(hào)循環(huán)放大(圖1),因此只要有微量的底物殘留,就會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生很大影響,并且從反應(yīng)曲線上無法看出是否存在污染。深圳邁瑞公司的TC項(xiàng)目試劑盒,通過優(yōu)化配方,從根本上解決了交叉污染問題。

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圖1 TBA檢測原理示意圖

2.提高儀器清洗能力阻斷污染之路:從儀器系統(tǒng)設(shè)計(jì)到關(guān)鍵器部件設(shè)計(jì)再到清洗時(shí)序設(shè)計(jì),步步精細(xì)化控制交叉污染,如圖2。不同清洗水溫度對(duì)試劑針攜帶污染的影響不同,隨著清洗水溫度增高,攜帶污染物殘留體積會(huì)降低,且對(duì)新舊試劑針的影響程度不同。

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圖2 生化分析系統(tǒng)清洗流程

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圖3 清洗水溫度對(duì)新舊試劑針攜帶污染的影響

3.完整的項(xiàng)目全遍歷交叉污染評(píng)估:在構(gòu)建封閉檢測系統(tǒng)時(shí),要對(duì)所有開展的項(xiàng)目進(jìn)行全遍歷交叉污染篩查,在理論分析的指導(dǎo)下,使用添加法做覆蓋性篩選,再全遍歷實(shí)測,一般取偏差<5%,或<1.6SD作為指標(biāo),也可以參考臨床指標(biāo)。這是一項(xiàng)系統(tǒng)性的工作,通常在新檢測系統(tǒng)構(gòu)建、增加新試劑、儀器試劑變更等情況下進(jìn)行。

交叉污染評(píng)估中SD的含義與指標(biāo)定義:評(píng)價(jià)項(xiàng)目間的交叉污染時(shí),評(píng)估被污染項(xiàng)目的濃度一般取該項(xiàng)目的醫(yī)學(xué)決定水平點(diǎn)濃度中的最低濃度點(diǎn)左右的值作為測試濃度(譬如:ALT醫(yī)學(xué)決定水平點(diǎn)為20U/L、60U/L、300U/L,那么評(píng)估交叉污染選取樣本濃度為20U/L左右),污染源項(xiàng)目則取該項(xiàng)目的線性上限濃度值。評(píng)估項(xiàng)目交叉污染時(shí)的SD選取被污染項(xiàng)目基準(zhǔn)濃度的批內(nèi)精密度SD(譬如,ALT為被污染項(xiàng)目,那么20U/L左右的濃度值測量10次或20次,計(jì)算SD),指標(biāo)取1.6SD。因Westgard質(zhì)控規(guī)則一般取2SD作為評(píng)判結(jié)果是否失控的警告限或離群標(biāo)準(zhǔn),選取2SD的80%作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn),即當(dāng)被污染結(jié)果小于1.6SD,認(rèn)為結(jié)果與正確值無顯著偏差;我們?nèi)∑钚∮?%或小于1.6SD,這個(gè)指標(biāo)是比較嚴(yán)格的,一般評(píng)估交叉污染的文獻(xiàn)上取10%作為可接受指標(biāo)[1]。

生化分析系統(tǒng)中其他試劑對(duì)鎂離子檢測的攜帶污染較難控制。各品牌生化儀為降低攜帶污染對(duì)鎂離子測定的影響,設(shè)計(jì)了多種控制方法。例如:羅氏 COBAS c701 設(shè)有12組鎂離子試劑針污染對(duì),貝克曼同時(shí)設(shè)有試劑針和攪拌桿的鎂離子污染對(duì), 邁瑞B(yǎng)S-2000M機(jī)型通過提升儀器清洗試劑針、攪拌桿和反應(yīng)杯的能力,將試劑針、攪拌桿和反應(yīng)杯對(duì)鎂離子的總系統(tǒng)污染率控制在0.04mmol/L以下,見圖4。

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圖4  BS2000生化分析系統(tǒng)鎂被污染的評(píng)估

4.儀器防交叉污染功能設(shè)計(jì)與測試流程優(yōu)化:儀器強(qiáng)大的防交叉污染功能可以有效避免項(xiàng)目間交叉污染的發(fā)生。在同一樣本內(nèi),測試項(xiàng)目根據(jù)項(xiàng)目間污染的情況優(yōu)化測試順序;在不同樣本間,則可通過設(shè)置強(qiáng)化清洗,并且根據(jù)項(xiàng)目污染的特性,智能選擇酸、堿或去離子水作為清洗劑。羅氏交叉污染對(duì)設(shè)置以及清洗劑選擇情況見表1,邁瑞B(yǎng)S-2000M交叉污染對(duì)設(shè)置以及清洗劑選擇情況見表2。

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自建檢測系統(tǒng)攜帶污分析策略

1.自建檢測系統(tǒng)所面臨的攜帶污染問題:自建系統(tǒng)所用試劑來源于不同廠家,試劑污染源成份復(fù)雜,通過試劑說明書很難判定試劑項(xiàng)目間是否存在污染,往往只能靠經(jīng)驗(yàn)以及樣本檢測過程中的結(jié)果異常去發(fā)現(xiàn)項(xiàng)目間交叉污染并進(jìn)行規(guī)避設(shè)置。檢測系統(tǒng)投入使用前,完整地去遍歷所有開展項(xiàng)目間的交叉污染,工作量大,而且往往需要檢驗(yàn)人員對(duì)儀器的工作流程十分了解。使用過程中增、減項(xiàng)目,又會(huì)改變項(xiàng)目的測試順序,也有可能帶來新的交叉污染。

2.自建檢測系統(tǒng)攜帶污分析策略:根據(jù)生化分析儀攜帶污染的分析評(píng)估及處理方法專家共識(shí)[2]試劑攜帶污染分析思路如下:收集現(xiàn)有的項(xiàng)目交叉污染的資料,包括但不限于制造商手冊、制造商通告、文獻(xiàn)等,尋找被污染項(xiàng)目可能受哪些項(xiàng)目的試劑污染;研究被污染項(xiàng)目所在的檢測單元的試劑分布、檢測程序,是否存在已知的“配對(duì)”交叉污染;分析被污染項(xiàng)目使用相同試劑針、攪拌桿、沖洗頭、比色杯等儀器原件,緊鄰的前一個(gè)項(xiàng)目是何項(xiàng)目,分析是否存在污染的可能;如已有的資料信息和結(jié)果信息無法提示到底被哪一個(gè)項(xiàng)目的試劑污染,則可以設(shè)計(jì)試驗(yàn)評(píng)估與被污染項(xiàng)目處于相同檢測單元中的所有其他項(xiàng)目試劑是否發(fā)生攜帶污染。

3.自建檢測系統(tǒng)交叉污染評(píng)價(jià)方案:以雅培公司Abbott Architect c8000臨床生化分析儀對(duì)32個(gè)生化項(xiàng)目的交叉污染評(píng)估為例[3],實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)見表3。實(shí)驗(yàn)室結(jié)果顯示以下項(xiàng)目配對(duì)之間不存在交叉污染:糖-鐵,鐵-糖;血紅蛋白-ALT,ALT-血紅蛋白;膽堿酯酶-Urea,Urea-膽堿酯酶;C4-肌酐,肌酐-C4;鋰-膽固醇,膽固醇-鋰;鐵-血紅蛋白,血紅蛋白-鐵。以下項(xiàng)目配對(duì)之間存在交叉污染(攜帶污染率%):鐵蛋白-堿性磷酸酶(-10.7%),鐵蛋白-CK(-10.5%),鐵蛋白-鐵(-10.7%),CRP-IgM(-15.8%),膽堿脂酶-總膽紅素(+15.4%),乳酸-鐵蛋白(-22.9%),尿素-鐵(-10.8%),HDL-二氧化碳(-7.2%),IgA-二氧化碳(-35.4%)。實(shí)驗(yàn)室通過設(shè)置額外的水、酸或者堿清洗后,試劑間的交叉污染滿足要求。 

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交叉污染案例分析

某患者曾出現(xiàn)左腳大腳趾關(guān)節(jié)紅腫及劇烈疼痛,懷疑是痛風(fēng)的表現(xiàn),隨即到醫(yī)院檢查。與導(dǎo)醫(yī)溝通后,得知自己的癥狀可能是痛風(fēng)也可能是風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病。在腎內(nèi)科就診后,心存疑慮的患者又就診于風(fēng)濕免疫科,醫(yī)院當(dāng)時(shí)未開通一卡通,因此患者就拿著兩個(gè)科室主診醫(yī)生開具的兩份檢測申請又分別在兩個(gè)不同的采血窗口進(jìn)行了采血登記,于是同一病人同時(shí)就有了兩份檢測結(jié)果,樣本1尿酸(UA) 647μmol/L,樣本2 UA 299μmol/L,兩份樣本結(jié)果差距巨大,于是實(shí)驗(yàn)室對(duì)兩個(gè)不同的測試結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。(1)重測兩份樣本,樣本1重測結(jié)果644μmol/L ,樣本2重測結(jié)果升高至660μmol/L;(2)樣本2(UA 299μmol/L)在科室另外一臺(tái)儀器上重測,結(jié)果652μmol/L;(3)重測部分其他病人UA樣本,重測結(jié)果與第一次測試結(jié)果沒有明顯偏差。實(shí)驗(yàn)室判斷樣本2 第一次測試結(jié)果不正確。實(shí)驗(yàn)室查看兩個(gè)樣本的反應(yīng)曲線,發(fā)現(xiàn)樣本2反應(yīng)監(jiān)測點(diǎn)13點(diǎn)后出現(xiàn)了一個(gè)明顯的負(fù)向反應(yīng),樣本1沒有,顯然這個(gè)反應(yīng)受到了干擾。檢查試劑、質(zhì)控結(jié)果均正常,其他樣本測試結(jié)果正常,因此懷疑在檢測過程中發(fā)生了攜帶污染。

引起攜帶污染的原因可能為攪拌棒、試劑針、比色杯以及樣本針等殘留前一個(gè)項(xiàng)目的物質(zhì),對(duì)下一個(gè)測試項(xiàng)目造成了干擾。首先懷疑試劑針的攜帶污染,查閱儀器檢測記錄,可見受干擾的UA測試前進(jìn)行了LDL-C及CHE測試。實(shí)驗(yàn)室的生化分析儀有兩個(gè)測試單元,LDL-C測試被安排在2號(hào)測試單元,而UA和CHE同在1號(hào)測試單元,可見測試單元1發(fā)生了CHE對(duì)UA的交叉污染。實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步做了交叉污染確認(rèn)試驗(yàn)驗(yàn)證,隨機(jī)選擇了兩個(gè)測試樣本,每個(gè)樣本分成4管,兩個(gè)樣本的測試設(shè)置均為先進(jìn)行一個(gè)CHE測試,再按管1~4進(jìn)行四個(gè)尿酸測試,結(jié)果見表4 。驗(yàn)證結(jié)果顯示CHE對(duì)尿酸檢測存在明顯的負(fù)干擾 。實(shí)驗(yàn)室將UA和CHE兩個(gè)項(xiàng)目分開放置,一個(gè)放置于內(nèi)圈,一個(gè)放置于外圈,使用不同的試劑針加樣,有效避免了兩個(gè)項(xiàng)目之間的交叉污染。

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小結(jié)

生化分析系統(tǒng)交叉污染,來源多,污染途徑復(fù)雜,分析中往往不容易察覺。廠家配套系統(tǒng),能夠從試劑配方污染源頭進(jìn)行設(shè)計(jì)控制,提高儀器的清洗能力從而斬?cái)辔廴就緩?,并且?jīng)過全遍歷評(píng)估以及交叉污染對(duì)規(guī)避設(shè)置,確保配套項(xiàng)目間不產(chǎn)生交叉污染。開放系統(tǒng)需要使用者自行驗(yàn)證哪些項(xiàng)目間存在交叉污染,工作量大,增減項(xiàng)目也會(huì)影響交叉污染,很難完全控制。保持檢測系統(tǒng)的完整性是避免交叉污染的有效手段,是檢測系統(tǒng)有效性的基本保證。