HRM(High Resolution Melting analysis，高分辨熔解曲線)同許多熒光PCR技術(shù)一樣，是利用特定dsDNA染料可以插入DNA雙鏈小溝中（PCR產(chǎn)物）的特性，通過實時監(jiān)測升溫過程中dsDNA解鏈，熒光染料脫落，熒光信號減弱或消失的過程，高分辨記錄熔解曲線，從而對樣品進行檢測。HRM技術(shù)利用dsDNA的物理性質(zhì)，準(zhǔn)確反映DNA序列堿基配對特異性與解鏈溫度變化的情況，無需使用特異性標(biāo)記探針，不受突變種類和突變位點的限制，具有高靈敏度和特異性、高通量、操作簡單靈活、成本低等優(yōu)點。實驗室檢測證明，在PCR反應(yīng)前或反應(yīng)后加入飽和dsDNA染料，對HRM分析，效果相同。在PCR后加入，可閉管進行HRM分析，無需凝膠電泳。HRM分析，不損傷PCR產(chǎn)物，用于HRM分析的PCR產(chǎn)物仍可用于電泳、膠回收、測序等一系列后續(xù)操作。HRM可應(yīng)用于核酸突變掃描、基因分型、甲基化檢測、短串聯(lián)重復(fù)序列分析、序列匹配和RNA編輯等多方面研究，已越來越受到國內(nèi)外核酸分子實驗室的歡迎和重視。
對于目前絕大多數(shù)的突變分析方法來說，都很難鑒定出純合子序列突變。在一些不同種類的小的擴增片段中，高分辨率熔解曲線則顯示出了鑒定純合子序列突變的能力，這種方法能鑒定出大多數(shù)的純合突變。HRM技術(shù)在遺傳學(xué)研究方面也帶來很大便利，只需在PCR反應(yīng)體系中加入雙鏈DNA飽和熒光染料，在PCR反應(yīng)之后再花15 分鐘，就可以完成96或384個樣品的DNA變異掃描。采用這種方法，當(dāng)片段的大小在400bp或者更小時，靈敏性最高。
一、HRM分析條件
1. 設(shè)備
PCR擴增產(chǎn)物的熔解曲線完全取決于DNA堿基序列，序列中如有一個堿基發(fā)生突變，都會改變dsDNA的解鏈溫度。但是這種變化差異極小，只有零點幾攝氏度，HRM技術(shù)需要區(qū)分Tm值差異極小的樣品，以鑒別單個堿基的差異，因此，對溫度分辨率的要求相當(dāng)高，如果儀器的分辨率不高，是無法檢測的。孔間溫度差異（溫度均一性：Tm的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.020～0.264℃），孔間溫度均一性要達到0.264℃以內(nèi)才能保證HRM分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。熔解速率，最低要求0.1℃/秒。數(shù)據(jù)密度，最低要求10個數(shù)據(jù)點/℃。目前市場上HRM分析儀器的供應(yīng)商，有專門用于HRM分析的儀器，也有附帶HRM功能的Real Time PCR儀。這些廠家包括：Roche, QIAGEN, Idaho Technology。市場上認可度較高的一些設(shè)備包括: HR-1、LightScanner-32、LightScanner-96和LightScanner-384(Idaho Technology Inc)，可采集55～95℃的熒光信號，變溫速率是0.02～0.1℃／s，每秒鐘可以采集200個數(shù)據(jù)資料。LightCycler 480s(Roche Diagnostics, Germany)和Rotor-Gene6000(Corbett)等傳統(tǒng)實時定量PCR儀加裝高分辨率熔解模塊后，采用qPCR-HRM方法可以實現(xiàn)對目的核酸片段的定量和定性檢測。
2. 染料
進行HRM分析的另一個必要條件是飽和染料。用于HRM分析的染料必須滿足兩個條件。首先，必須是飽和染料。所謂飽和染料是指染料必須能飽和結(jié)合于DNA雙鏈所有小溝位置，也就是染料相對于dsDNA要相對過量，以使dsDNA沒有更多位置結(jié)合染料，在dsDNA升溫解鏈時，飽和染料從雙鏈上脫落，熒光信號同步減弱，準(zhǔn)確反應(yīng)出樣品熔解溫度（Tm）、熔解曲線的不同（如圖1-A）。SYBR Green I染料廣泛用于qPCR，但屬于非飽和染料，不能封閉dsDNA的所有小溝位置，遠未將DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝飽和。這樣，DNA雙鏈高溫逐步變性時，部分熒光染料分子會隨機結(jié)合到尚未解鏈的雙鏈DNA空置的小溝位置，染料分子發(fā)生重排，造成熒光信號混亂，特異性下降，不能準(zhǔn)確反映dsDNA解鏈過程（如圖1-B）
圖1：dsDNA解鏈前后熒光染料結(jié)合情況。A(左圖):飽和染料在dsDNA解鏈時，熒光分子同步脫落，信號減弱。B(右圖):不飽和染料在dsDNA解鏈時，熒光分子重新結(jié)合于未解鏈的dsDNA部位，熒光信號沒有變化，不能反應(yīng)樣品熔解溫度(Tm)。
其次，染料不能抑制PCR反應(yīng)。SYBR Green I染料不是飽和染料，加大染料濃度，不但不能飽和結(jié)合dsDNA小溝位置，還會抑制PCR反應(yīng)進行，造成擴增反應(yīng)無序，混亂。
用于HRM分析熒光染料如LC Green, Ly Green, eva Green等均為飽和染料，能飽和結(jié)合于PCR反應(yīng)產(chǎn)物的雙鏈小溝內(nèi)，同時這些染料不會抑制PCR反應(yīng)。Ly Green為2015年最新推出的HRM分析專用染料，除具有飽和染料、不抑制PCR等特點外，熒光信號穩(wěn)定、實驗重復(fù)性好時期突出優(yōu)點（如圖2）。
圖2. LyGreen染料用于綿羊FecB基因HRM分析.
HRM分析設(shè)備為LightCycler@480熒光定量PCR儀(德國羅氏)
二、HRM分析流程
1. 引物設(shè)計合成
據(jù)基因序列應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計、合成正向引物，反向引物（或依據(jù)參考文獻）。將引物稀釋成10mmol/L的工作濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>
2. 反應(yīng)體系
試劑 | 用量 |
ddH2O | 計算加水量，按終體積50μL |
Taq DNA poLymerase | 5U |
2mM的 dNTP | 5 uL |
50mM MgCl2 | 2.5uL |
20 X LyGreen | 2.5uL |
10 x 無鎂聚合酶緩沖液 | 5uL |
引物 | 0.1-1 uM（終濃度） |
注：1）50μL反應(yīng)，根據(jù)引物及擴增DNA長度不同，可進行優(yōu)化。
2）染料在反應(yīng)前加入或反應(yīng)后加入對反應(yīng)影響不大，反應(yīng)前加入，可實現(xiàn)閉管操作。
3. 擴增及HRM程序
三、HRM分析局限性及解決辦法
1. 熔解設(shè)備自身溫差。在所有的熔解系統(tǒng)中，孔與孔之間都存在微小的溫度差異，故影響檢測的靈敏性。如果孔與孔間的溫度差異為0.1℃，則最終的樣品熔解溫差也可能是0.1℃。因此，HRM對儀器溫度的均一性要求非常高。為解決這一問題，可以在PCR體系中加入2種溫度內(nèi)標(biāo)，低溫時熔解和高溫時熔解。HRM儀上的分析軟件可以根據(jù)這2種內(nèi)標(biāo)的熔解峰在熔解曲線中的位置來糾正孔與孔之間的溫度差異，可顯著提高檢測的靈敏性。
2. PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)體系中，核酸模板質(zhì)量要經(jīng)過檢測，濃度要均一。在分析多樣本時，模板外的其他共同組分要先混合均勻后，再分別加入樣品模板，以保證反應(yīng)體系的均一性。若在PCR反應(yīng)后加入飽和熒光染料，通常不需要對反應(yīng)條件做任何改變；若在PCR反應(yīng)前加入染料，可以實現(xiàn)真正的閉管操作，避免污染。但此時需要對原來的反應(yīng)條件做一定的改變，通常需要增加Mg2+濃度2～3 mmol/L，增加退火溫度1～5℃。隨著Mg2+濃度的增加，Tm值也會升高，當(dāng)Tm值超過熔解設(shè)備所允許的最高溫度時，還需要加入二甲基亞砜DMSO(10％)或甜菜堿(0.5 mol/L)來降低Tm值。在某些情況下，為快速找到反應(yīng)體系最適的退火溫度，需要做梯度PCR試驗。在PCR反應(yīng)程序的最后，一定要加入解鏈和退火的步驟，以增加PCR產(chǎn)物的雜合度，提高試驗的分辨率和準(zhǔn)確度。
3. 引物的二聚體。PCR產(chǎn)物高純度的PCR特異性產(chǎn)物是獲得HRM分析結(jié)果較高特異性的前提，在PCR引物設(shè)計時，一定要避免引物的二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)，盡量降低基因組其他片段的非特異性結(jié)合。根據(jù)所用擴增酶的情況，要嚴格控制PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)，以降低非特異性擴增增加的風(fēng)險。根據(jù)試驗?zāi)康?，要嚴格控制擴增片段的長度。試驗結(jié)果表明，隨著擴增片段長度的增加，HRM結(jié)果的靈敏度和特異性會降低，當(dāng)擴增片段長度為400-1000 bp時，檢測的靈敏度為96.1％，異性為99.4％。對于一些差異只有1-2 bp的基因片段進行分型時，需要借助探針才能解決。擴增子不能太長，當(dāng)檢測大片段如整個外顯子或內(nèi)含子的突變位點時，就要使用多對引物，將大片段分別擴增檢測。同其他任何基于PCR反應(yīng)的突變檢測一樣，HRM不能檢測外顯子、內(nèi)含子或整個基因等大片段的缺失突變。
4. 轉(zhuǎn)換純合突變子檢測。目的片段突變或多態(tài)位點的類型在轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失4大類堿基突變類型中，雜合突變子產(chǎn)生的Tm值差異最大，顛換純合突變子的Tm值差異在0.8～1.4℃之間，HRM技術(shù)可以對其準(zhǔn)確分型。但轉(zhuǎn)換純合突變子產(chǎn)生的Tm值差異通常小于0.4℃，HRM技術(shù)不能對其準(zhǔn)確分型，此時需要采用小片段法或非標(biāo)記探針法。使用小片段法時，片段長度一般設(shè)計為40～90 bp，包含1個SNP位點為宜。使用探針法時，熔解曲線上會出現(xiàn)2個峰圖，可以進行2次SNPs分析，且探針與其互補區(qū)結(jié)合形成的雙鏈部分更短，更能增加試驗的靈敏度，從而增加對純合突變子的分型準(zhǔn)確性。
5. 樣品的提取方法一致。樣品基因組提取方法樣品基因組不同的提取方法會對PCR后產(chǎn)物熔解曲線的形狀和分析結(jié)果產(chǎn)生很大的影響，因此，待分析樣品的提取方法要一致。為找出較為合適的提取方法，實驗室可根據(jù)自身條件設(shè)計不同基因組提取方法對HRM結(jié)果影響的試驗，找到較為理想的提取方法或較為理想的基因組提取試劑盒。
6. 飽和熒光染料的差異LC-Green、Syt09、ResoLight Dye和Ly Green,等飽和熒光染料的性質(zhì)差異不大，可以相互替代，試驗時只需要對PCR緩沖液和反應(yīng)條件做微小的調(diào)整即可。SYBR Green I染料為非飽和熒光染料，在檢測核酸微小變異時存在缺陷，因此一些研究者們不建議采用。
四、HRM技術(shù)展望
HRM技術(shù)具有高通量、高靈敏度和特異性、操作簡單靈活、成本低、對DNA分子無損害、閉管操作等諸多優(yōu)點。在畜牧業(yè)方面，通過對畜禽基因組突變位點的關(guān)聯(lián)性分析和連鎖性分析，HRM技術(shù)可以鑒定出更多的與畜禽特定經(jīng)濟性狀相關(guān)的SNPs位點，增加畜禽參考群育種值估計的準(zhǔn)確性，還可以增加畜禽分子疾病的檢出率，并為其遺傳疾病和基因突變所致疾病的分子診斷提供革命性手段。在農(nóng)業(yè)方面，HRM技術(shù)將增加作物遺傳標(biāo)記位點的密度，加快作物高產(chǎn)、抗逆性等優(yōu)良性狀的改良進度。隨著消費者食品安全意識的增強和行業(yè)競爭的日趨激烈，對食品微量成分種類和含量的檢測日益重要，HRM技術(shù)因其較高的靈敏度和特異性，必將發(fā)展成為一種可靠便捷的檢測手段。在人類疾病的診斷方面，HRM技術(shù)必已經(jīng)從試驗研究走向臨床診斷，成為人類分子疾病臨床診斷的新手段。因此，HRM技術(shù)的應(yīng)用范圍將會進一步拓寬，并越來越受到核酸研究者的重視。
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產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 保存 | 價格（元） |
LyGreen (20×in water) HRM專用染料（20×水溶液） | D1101L1128 | 1ml | 4℃ | 450.00 |
LyGreen (20×in water) HRM專用染料（20×水溶液） | D1101L1129 | 5 x 1ml | 4℃ | 1650.00 |